华中农业大学研究生处，华中农业大学研究生处分
蛋白质的O-连接糖基化是实现蛋白质功能多样化、动态地调节胞内信号整合和细胞生理状态的关键机制。研究表明异常的蛋白质O-连接糖基化与人类的多种疾病 （糖尿病、多种神经退行性疾病和癌症等） 以及植物的许多发育障碍有关 【1-4】 。植物SPINDLY(SPY) 蛋白在植物发育过程中发挥着多效性作用，包括生物钟调控、植物激素细胞分裂素信号转导、植物构型、根系发育、非生物和生物胁迫等 【1】 。SPY为糖基转移酶GT41家族成员，定位于细胞质和细胞核。尽管其与人源N-乙酰氨基葡萄糖转移酶OGT的氨基酸序列相似性较高，研究表明SPY是一种作用于核质蛋白的新型O-连接岩藻糖基转移酶，可特异性地催化赤霉素信号转导关键转录因子DELLA以及生物钟核心元件PRR5并调控这些蛋白的功能 【5,6】 。SPY同源蛋白广泛存在于许多生命物种，包括原核生物、原生生物、藻类和所有植物，这表明SPY催化蛋白发生O-连接岩藻糖基修饰是一种广泛存在的调控胞内蛋白功能的方式。然而，SPY如何特异性识别糖基供体GDP-fucose以及被修饰的蛋白底物，以及如何催化fucose转移的分子机制尚不清楚。
2022年12月2日，湖北洪山实验室、华中农业大学生命科学技术学院徐曙彤教授课题组在Nature Communications在线发表题为“Structural insights into mechanism and specificity of the plant protein O-fucosyltransferase SPINDLY”的研究论文。该研究综合运用结构生物学和生物化学等多学科手段，全面阐释了植物新型蛋白质岩藻糖基转移酶SPY特异性利用GDP-fucose作为糖基供体，催化DELLA等定位于核质中的蛋白质底物发生O-连接岩藻糖基化修饰的分子基础。
徐曙彤教授课题组解析了全长的拟南芥SPY与GDP复合物的晶体结构，分辨率为2.85Å。SPY主要由TPR （tetratricopeptide repeats） 结构域以及C端的催化结构域 （catalytic domain） 构成。TPR结构域包含11个TPR重复序列，形成一个狭长的超螺旋结构；催化结构域则包含了两个Rossmann折叠样的结构 （N-terminal lobe，N-Cat和C-terminal lobe，C-Cat） 。TPR结构域的N端43个氨基酸性成了一条游离的长loop。GDP则结合在C-Cat的表面，位于N-Cat和C-Cat形成的口袋中。通过结构比对，研究人员发现SPY的整体结构与之前报道的GT65家族的定位于内质网的O-连接岩藻糖基转移酶的结构差异巨大，而与GT41家族的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶OGT的结构存在一定的相似性。然而与OGT不同的是，SPY的TPR超螺旋更为细长，组成催化结构域的两个Rossmann折叠仅由短小的loop相连，且TPR超螺旋与催化结构域之间的夹角增大了大约30°。此外，两个SPY分子形成一个独特的首尾相连的二聚体，这与数据库中现有的GT41家族酶的二聚体构象都截然不同。
研究者经过进一步的细致分析，在晶格中意外发现SPY的N端长loop与对称相关分子的TPR超螺旋内壁形成了紧密互作，且一直深入到对称相关分子的活性位点中心，形成了“催化型SPY”/GDP/“底物型SPY”三元复合物构象（ 图1） 。这是人们首次观察到完整的GT41家族酶与蛋白底物的结合模式。进一步的生物化学分析证实SPY可以催化自身发生O-连接岩藻糖基化修饰，且自修饰区域可以负调控其酶活；TPR超螺旋内壁上的一系列天冬氨酸形成一个梯子样结构，负责结合底物蛋白，而位于TPR超螺旋中部的K231和D266参与决定了SPY对蛋白质底物的选择性。
图1. “催化型SPY”/GDP/“底物型SPY三元复合物、酶学分析与催化机制
过去的研究表明糖基转移酶通常利用天门冬氨酸、谷氨酸或组氨酸作为general base，促使被修饰的丝氨酸或苏氨酸发生去质子化被活化，从而亲核进攻糖基供体，最终夺取糖基。然而研究者在SPY的活性位点并未发现能够行使general base功能的氨基酸。有趣的是，底物型SPY上潜在将被修饰的丝氨酸与GDP的α-磷酸基团形成了氢键，研究者因而推测SPY采用了底物辅助型催化机制，其中GDP的α-磷酸基团担当了general base的角色 （图1） 。
此外，研究者将“催化型SPY”/GDP/“底物型SPY”复合物结构与OGT/UDP-GlcNAc/HCF-1复合物结构进行比较，发现SPY中由于Y744的存在，其活性中心口袋相较于OGT的小很多，因而无法同时容纳蛋白底物与UDP-GlcNAc这些糖基部分相对较大的糖基供体，只能特异性地利用GDP-fucose作为糖基供体。通过与GT41家族其他蛋白进行序列比对，研究者发现SPY的Y744保守性较差。在体外生化实验证实具有N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的蛋白中，该位点均为小侧链氨基酸 （半胱氨酸） ，而其他成员则为大侧链氨基酸 （酪氨酸或苯丙氨酸） 。这表明GT41家族酶极有可能都是利用SPY Y744对应的位点选择其糖基供物底物。
综上所述，该研究阐释了SPY的酶活调控机制；揭示了SPY识别糖基供体和蛋白底物的机理；阐明了SPY独特的酶学催化反应机制；同时为GT41家族成员特异性选择糖基供体提供理论依据。
华中农业大学生命科学技术学院博士研究生朱立与韦熹婷硕士为论文共同第一作者，徐曙彤教授为通讯作者。该课题组多名博士研究生和硕士研究生参与了研究。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、校自主创新基金等项目的支持。
据悉，徐曙彤课题组长期招聘博士后。诚挚欢迎有结构生物学、生物化学、细胞生物学、化学生物学或药物设计与开发等背景的优秀博士毕业生加入。
参考文献：
1 Sun, T. P. Novel nucleocytoplasmic protein O-fucosylation by SPINDLY regulates diverse developmental processes in plants. Curr Opin Struct Biol68, 113-121, doi:10.1016/j.sbi.2020.12.013 (2021).
2 Schneider, M., Al-Shareffi, E. & Haltiwanger, R. S. Biological functions of fucose in mammals. Glycobiology27, 601-618, doi:10.1093/glycob/cwx034 (2017).
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4 Olszewski, N. E., West, C. M., Sassi, S. O. & Hartweck, L. M. O-GlcNAc protein modification in plants: Evolution and function. Biochim Biophys Acta1800, 49-56, doi:10.1016/j.bbagen.2009.11.016 (2010).
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6 Silverstone, A. L. et al. Functional analysis of SPINDLY in gibberellin signaling in Arabidopsis. Plant Physiol143, 987-1000, doi:10.1104/pp.106.091025 (2007).
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-35234-0#Ack1
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