中国环境科学研究院，中国环境科学研究院什么级别
近年来，随着食源性疾病的暴发，食源性致病菌成为影响食品质量与安全的首要因素，食品从原材料生产到最终消费都可能通过与水、空气、土壤、肥料及食品加工环境的接触而被病原体污染。
因此，为了确保食品安全，在将食品投放市场之前，使用可靠、有效的方法检测病原菌至关重要。简便、特异、灵敏、低耗且适用的快速诊断及检测食品中致病微生物的方法被广泛应用。近年来，食源性致病菌快速检测技术获得了很大的进展，长春大学食品科学与工程学院的王丹丹、吴淑清*和中国检验检疫科学研究院的吴亚君*等人就目前常用微生物快速检测技术的应用和研究现状作总结概述，以期对我国食品快速检测领域的发展提供参考。
01
食源性致病菌快速检测技术的分类
显色培养基技术
定位显色培养基是一种基于生化反应的微生物鉴定技术，其原理是根据不同微生物胞内酶反应条件的差异作为分类鉴定的依据，在分离培养基中加入特定的底物，这些底物由微生物可代谢的物质及发色基团组成，在微生物特异性酶的作用下，发色基团游离并显色，通过观察菌落的颜色就能够对菌种进行鉴别。
ATP发光法
ATP发光法是一种快速且便捷的操作技术，只需要几分钟便可以得到检测结果。ATP在细胞代谢中起重要作用，其含量可以直接代表活细胞数，原理是将细菌中的ATP提取出来，和荧光素酶、氧气、镁一同和虫荧光素发生反应产生荧光，通过反应产生的荧光推测计算其ATP的含量，从而得到所测样品中细菌的含量。目前，ATP发光技术在大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌的检测中得到了应用。
免疫学技术
酶联免疫吸附试验技术
酶联免疫吸附试验（ELISA）技术是用酶标记表面吸附抗原或抗体的固相载体，其与相应的抗体或者抗原相结合，形成带有酶标记的复合物，得到的携带酶的复合物可与特定底物反应产生颜色变化，通过对该产物的定量分析，从而达到检测目的，抗体是确定ELISA灵敏度和特异性的关键因素。
免疫荧光技术
免疫荧光技术是采用荧光素标记已知抗原或抗体，与特异抗体或者抗原结合后产生荧光的原理实现检测目标致病菌的目的。Ozeh等将免疫荧光技术与光电动力学技术相结合用于水中大肠杆菌的检测和定量，并在4 h内检测限达到104 CFU/mL。较传统ELISA而言，该技术检测时间更短，灵敏度更高。但该技术判定结果的操作过程较繁琐，且需要专业人员操作，因此在食源性病原菌检测方面应用较少。
胶体金免疫层析技术
胶体金免疫层析技术（GICA）是以胶体金作为标记物检测特定抗原或抗体的免疫标记技术，其以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，待测物受体与样品反应，产物被聚集到层析材料的某一位置，通过胶体金可直接观察实验现象。
分子生物学技术
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（PCR）检测技术中实时荧光PCR和多重PCR技术在快速检测中的应用比较广泛，其中实时荧光PCR技术是在PCR反应体系中加入了荧光基团，在反应过程中随着荧光信号的积累来实时监测PCR反应进程，最后通过标准曲线来定量分析样品中的待测成分。相比于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术能实现实时对待检成分进行定性、定量分析，省去电泳步骤，节省了时间。
等温扩增技术
1）环介导等温扩增技术：环介导等温扩增技术（LAMP）是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，在链置换DNA聚合酶、60～65 ℃恒温条件下在体外扩增核酸的技术。王瑾根据沙门氏菌invA基因序列设计了特异性引物，建立了沙门氏菌LAMP检测方法，该方法检测仅需45 min，灵敏度达到6 CFU/mL。LAMP技术也被运用到创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌的检测。
2）重组酶聚合酶扩增技术：重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是另一种新颖的等温扩增技术，由特定的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶结合，在常温条件下进行反应，5～20 min即可获得与LAMP一样的检测结果。
3）滚环扩增技术：滚环扩增（RCA）技术是DNA分子以滚环式复制的一种恒温扩增技术，其关键在于构建一个完整的单链DNA环用于后续扩增，RCA主要有线性RCA、超分支RCA和多引物RCA。Hao Liling等设计了金黄色葡萄球菌的RCA反应，反应中产生的单链DNA用于捕获反应中形成的游离复合物，从而较少量的复合物吸附在纳米材料上，保持原有化学发光，实现信号放大，结果表明在最优条件下该方法对纯培养的金黄色葡萄球菌的检测限可达15 CFU/mL。
基因芯片技术
基因芯片技术（DNA chip）又称DNA芯片、DNA微阵列技术，其主要利用核酸分子杂交，是通过基因芯片上固定的已知序列的核酸或核酸片段去确定被检测的DNA样品，因其通量高、自动化程度高等被广泛应用在各个领域。
微流控芯片技术
微流控芯片技术（microfluidic chip）又称为芯片实验室，结合分析化学、微机电加工技术、微管道网络、生命科学等多个技术，其将样品制备、反应、分离、检测等多个步骤集成到一张芯片上，较基因芯片大多只能使用一次而言，微流控芯片能够多次使用，因此更有发展前景。其通常借助光学方法或荧光信号检测将扩增的DNA可视化。
高通量测序技术
二代测序技术实现了对全基因组的研究，把DNA测序引入到高通量测序时代，但是二代测序技术读长过短、易引入PCR扩增错误且具有碱基GC偏好性，因此三代测序应用而生，与二代测序的边合成边测序相比，三代测序不需要进行PCR扩增，避免PCR扩增引入错误，同时第三代测序具有更高的通量和测序效率。
生物传感器技术
生物传感器是由生物感受器和换能器两大部分组成的分析装置，检测微生物时主要利用抗原（抗体）以及各种敏感酶、生物碱和基因序列等，若待测样品与以上物质反应，便会产生生物相互作用，随后信号转换器可将其转化为一些可测量的电信号，再由信号放大器进行读取检测。通常用于快速检测食源性病原体的生物传感器有光学生物传感器、电化学生物传感器以及机械生物传感器。
流式细胞技术
流式细胞技术（FCM）是基于细胞直接计数的一种微生物快速检测方法，流式细胞计数装置一般包括液流系统、光学系统、信号收集与转换系统、分析系统。其使用激光对通过激光束的颗粒进行计数，从而实现细胞的定量观察和定性分析，当颗粒或者细胞通过激光束的时候，会对光线产生折射和反射，此信号被探测器记录下来，每通过一个细胞，就会产生一个峰值，最后根据峰值的个数得到细胞的数值。FCM对食品中的活菌数直接进行检测，速度快，无需增菌，可在90～100 min内出具检测结果；灵敏度高，甚至可检测出1 个活的微生物或活细胞；该检测技术适用于水、液态加工食品、饮料、化妆品及药品等行业。
光谱技术
随着光学仪器、光学技术以及计算机技术的快速发展，光谱检测技术得以快速发展，拉曼光谱技术和表面增强拉曼光谱技术、傅里叶变换红外光谱技术被广泛用于微生物的快速检测。拉曼光谱技术是通过测定代谢分子反应物质分子内部化学键的情况，从而确定微生物的种类。
质谱鉴定技术
质谱技术是一种根据离子产生的质量图谱来确定样品中分子组成的分析技术。质谱技术不仅可以对传统的目标分析物进行定性和定量分析，还可以用于细菌的快速准确鉴定。在微生物的分析中，通过单个质量峰对微生物进行鉴定，从而实现微生物鉴定的快速性和有效性，其检测过程高度自动化，极大加强了其简便性与应用广泛性。微生物检测常用的质谱技术主要包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）、基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）及电喷雾质谱（ESI-MS）等。
02
结 语
近年来，已开发出许多检测食源性病原体的方法，以解决食品安全和公共卫生问题，特别是随着对新鲜食品和短保质期食品的食用不断增加，快速检测技术更具市场，众多学者在不同快速检测技术上都不断革新，在检测时间、灵敏度以及准确度上都有了很大的提升，但也还存在着不足，需要国内外研究者不断地完善和改进现有的检测技术。
一方面，几乎所有的快速检测技术都存在灵敏度不足的缺点，因此还需富集、培养等过程才可以得到检测结果，免疫磁分离技术是一种经常被用在前处理过程中以提高检测灵敏度的技术，其已成功用于富集和分离多种病原体，可以有效消除样品基质中的聚合酶抑制剂，从而在检测致病菌时缩短了富集时间并提高了灵敏度。快速检测技术发展的方向应符合食品安全检测的要求，实现高精度、高效率、低成本方式在线监测病原体。
另一方面，人工智能、基因编辑、纳米技术等前沿学科融入到食源性致病菌的快速检测，也将成为未来的发展趋势。同时，在检测过程中，还可以根据检测要求选择适当的技术，并且可以尝试将未来多学科交叉结合使用，发挥各学科的优势，并实现优势互补，从而提高检测的灵敏度、增加检测准确性、缩短检测时间。
另外，国内现行的标准几乎没有针对食源性致病菌快速检测的方法，无法满足检测和监管的需求，因此还亟待制定一系列快速检测技术的国家标准、行业标准、地方标准等，弥补快速检测标准缺乏的现状。
本文《食源性致病菌快速检测技术研究进展》来源于《食品科学》2022年43卷3期276-285页，作者：王丹丹，刘鸣畅，杨艳歌，王洪越，袁飞，吴亚君，吴淑清。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201105-048。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。
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