西北农林科技大学研究生，西北农林科技大学研究生院
氮元素是生物体构成的主要元素之一。氮是植物生长的主要限制因素，是农业生产力，动物和人类营养以及可持续生态系统的基础。光合植物通过将无机氮同化为维持植物和依赖它们的食物网的生物分子（DNA，RNA，蛋白质，叶绿素和维生素）来驱动陆地氮循环。为了与土壤中更喜欢有机氮或铵的微生物竞争，大多数植物已经进化出对硝酸盐可用性波动做出反应的调节途径。感知可用硝酸盐的植物将在几分钟内协调转录组，新陈代谢，激素，全系统芽和根的生长以及繁殖反应。长久以来科学家们只是能够在基因水平确定硝态氮是一种信号分子，但并不清楚植物感受它的机制。
其次，氮肥是能源密集型生产并造成污染;此外，它在农业中的过度使用以提高作物产量，导致全球环境灾难性的富营养化。全球和区域研究表明，地球上的氮供应量正在下降。提高植物氮利用效率有助于可持续农业和生态系统保护。这些年，研究者们关于硝态氮的研究，一直热情不减，很多研究者们认为NRT1.1蛋白（也称为CHL1或NPF6.3）不仅仅是质膜细胞外硝酸盐转运体传感器（转感受器），同时也是硝酸盐的感受器，具有感受硝态氮的功能。但刘坤祥教授根据多年研究认为，CHL1/NRT1.1蛋白不是一个主要的硝酸盐感受器，他带领团队夜以继日地研究,尝试解释清楚这一机制。
2022年9月23日，《Science》期刊刊登了西北农林大学、台湾籍教授刘坤祥团队和其合作团队在植物硝酸盐信号“开关”——NLP7蛋白的最新研究成果，相关论文题为 “NIN-like protein 7 transcription factor is a plant nitrate sensor” 在这项研究里，研究者们发现所有七个拟南芥 NIN 样蛋白 (NLP) 转录因子的突变消除了植物的初级硝酸盐反应和发展计划。 NIN-NLP7 嵌合体和硝酸盐结合的分析显示NLP7 通过其氨基末端对硝酸盐的感知被解除抑制。基因编码的荧光拆分生物传感器，mCitrine-NLP7，实现了植物中单细胞硝酸盐动力学的可视化。硝酸盐传感器NLP7 的结构域类似于细菌硝酸盐传感器 NreA。 保守残基的替换配体结合口袋损害了硝酸盐触发的 NLP7 控制转录、转运、新陈代谢、发育和生物量。这项结果表明转录因子NIN样蛋白7（NLP7）为主要的硝酸盐传感器。其中，刘坤祥教授和Jen Sheen为共同通讯作者，西北农林大学生命学院博士生刘孟红、林子炜，师资博士后陈斌卿以及Zi-Fu Wang为共同一作为共同第一作者，西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室、生命学院、未来农业研究院为第一署名单位。
组合 NLP 控制初级硝酸盐反应
图 1.组合 NLP 转录因子是原发性硝酸盐反应和发育计划的核心。
由于所有九个NLP基因都在拟南芥芽中表达。对硝酸盐介导的芽生长中单个nlp1-9单个突变体的分析显示，仅在nlp2和nlp7中存在统计学上显着的缺陷。为了规避NLP冗余并更好地定义NLP1-9的重叠或独特功能，我们进行了全基因组靶基因调查。每个NLP在土壤生长植物的转染叶细胞中瞬时表达4.5小时，用于RNA测序（RNA-seq）分析。推定的NLP靶基因的分层聚类分析（日志2≥ 1 或 ≤ −1;P ≤0.05）揭示了所有NLP激活先前通过微阵列、RNA-seq、片上染色质免疫沉淀（ChIP-chip）、ChIP-seq和启动子分析鉴定的通用原代硝酸盐响应性标记基因的能力。NLP2、NLP4、NLP7、NLP8 或 NLP9特异性激活了一些在调节生长素和细胞分裂素激素功能、细胞周期、代谢、肽信号传导以及芽和根分生组织活性方面具有已知功能的靶基因。NLP2和NLP7调节具有多种功能的更广泛的非冗余靶基因，这可能表现为在种子萌发后在nlp2或nlp7中观察到的生长缺陷。NLP6/7主要作为转录激活剂，而NLP2，4，5，8，9可以激活或抑制靶基因。NLP1，3，6比其他NLP调节的靶基因更少。例如，生长素生物合成基因TAR2仅被NLP2，4，5，7，8，9激活。这些结果与NLP变体在控制硝酸盐响应网络和导致土壤中生长的nlp2，4，5，6，7，8，9隔突变植物中发育迟缓的芽和根系发育的NLP变体一致。
基因编码的荧光生物传感器可视化植物中的硝酸盐
图 4.遗传编码的生物传感器检测转基因芽和根部的细胞内硝酸盐。
配体-传感器相互作用可能触发传感器蛋白的构象变化。我们产生了一个遗传编码的荧光生物传感器mCitrine-NLP7，类似于基于单个荧光蛋白的葡萄糖生物传感器Green Glifon。我们假设硝酸盐结合的分裂米西特林-NLP7硝酸盐生物传感器（sCiNiS）将重建麦西特罗以发出荧光信号。预测的核定位信号（630断续器638）的NLP7突变为AAAAA，以避免与内源性NLP7的竞争，内源性NLP7在硝酸盐诱导后保留在细胞核中以进行转录活化.在转基因植物子叶的叶肉细胞和根尖的腔内膜细胞中，通过sCiNiS对细胞质硝酸盐进行定量共聚焦成像。在硝酸盐（10mM）后5分钟内检测到重组的mCitine荧光信号，但不是KCl，在正常发育的完整sCiNiS转基因幼苗中以单细胞分辨率诱导叶肉细胞和原代根尖细胞。土壤硝酸盐浓度可以从微摩尔到毫摩尔范围变化。我们使用不含硝酸盐的转基因幼苗测试了不同的硝酸盐浓度，并表明sCiNiS生物传感器在完整植物的单个叶肉细胞中检测到100μM至10mM的硝酸盐浓度范围，与敏感和特异性的硝酸盐结合K一致。
植物中硝酸盐传感器的进化保护
图 5.NLP7传感器域类似于NreA，具有用于硝酸盐感知和信号传导的保守残留物。
为了在功能上定义NLP7中硝酸盐结合的必需残基，我们对硝酸盐-NreA晶型中定义的八种推定的硝酸盐结合残基进行了丙氨酸扫描诱变，并检查了无硝酸盐叶细胞中突变NLP7的硝酸盐反应。NLP7突变的四个残基，Trp395→阿拉（W395A），H404A，L406A或Y436A，在低硝酸盐（0.5mM）下显着降低硝酸盐诱导的4xNRE-min-LUC活性2小时。因为H404，L406和Y436在NLP2，4，5，6，8，9中是保守的，在硝酸盐结合域中具有相似的结构。我们接下来生成并分析了NLP7的双重（HL / AA）和三重（HLY / AAA）突变体，其消除了硝酸盐诱导的4xNRE-min-LUC活性。HLY硝酸盐结合残留物在作物植物结构相似的硝酸盐传感器域内的NLP7同源物中也是保守的，包括油菜籽BnaNLP7，大豆转基因NLP6，玉米ZmNLP6，小麦TaNLP7和水稻OsNLP3。我们建议NLP7及其同源物可以作为硝酸盐传感器，保存在从炭藻植物到被子植物的光合植物中，包括真双子叶植物和单子叶植物，但不是叶绿素。
总结：作者揭示了光合植物用来感知无机氮的调节机制，然后激活植物信号网络和生长反应。我们的见解可能会建议提高作物氮利用效率，减少肥料和能源投入以及减轻温室气体排放引起的气候变化的途径，以支持更可持续的农业。
来源：高分子科学前沿
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西北农林科技大学研究生(西北农林科技大学研究生院)