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随着生活水平的提高，人们的饮食结构发生明显变化，这导致肥胖及其他各种代谢性疾病发生率显著提升，例如高血脂症、高血压、动脉粥样硬化等疾病，尤其是心脑血管疾病已经成为我国死亡率第一的疾病，这引发了大众的广泛关注。肝脏是脂质代谢的重要器官，并且脂类代谢的紊乱主要发生在肝脏，所以肝脏内异常的脂质代谢会导致脂肪肝、肝细胞相关的慢性疾病、高血脂症等代谢综合征的发生。
黑木耳性平味甘，具有滋补、润燥、养血益胃的作用。关于木耳及其活性成分的降脂作用，已有很多报道，南京农业大学食品科学技术学院的陶 嘉、唐 超、陆兆新*等人以黑木耳为原料，通过提取蛋白，将其酶解成多肽后，超滤获得不同分子质量的多肽。用棕榈酸（PA）诱导人类肝癌HepG2细胞构建脂肪肝细胞模型后，在培养基中加入黑木耳多肽，通过共培养探究木耳多肽对细胞脂质代谢的调节作用。
1、高脂HepG2细胞模型的建立
棕榈酸对HepG2细胞存活率的影响
不同浓度的PA与HepG2细胞共培养24 h后细胞的存活率如图1所示，与空白对照组和阴性对照组相比，在PA浓度低于200 μmol/L时，细胞存活率没有显著降低（P＞0.05），此时不影响细胞的正常生长，而当PA浓度高于300 μmol/L时，细胞存活率显著下降（P＜0.05），说明此时PA对细胞产生了毒性作用。因此后续实验选用含0（阴性对照组）、100、150、200 μmol/L PA的培养基建立高脂细胞模型。
棕榈酸对HepG2细胞TG含量的影响
由图2可知，与阴性对照组相比，HepG2细胞在含PA培养基中培养24 h后，浓度为150、200 μmol/L的PA组细胞内TG含量显著升高（P＜0.05），200 μmol/L的PA组TG含量为阴性对照组的1.70 倍。Mayer等将HepG2细胞暴露于250 μmol/L PA中24 h，细胞内TG水平升高为正常细胞的1.50 倍。
2、黑木耳降脂多肽的筛选
黑木耳多肽对HepG2细胞存活率的影响
通过超滤技术将黑木耳多肽按照分子质量大小分为4 部分（＜3 kDa、3～10 kDa、10～30 kDa、＞30 kDa），不同质量浓度黑木耳多肽与HepG2细胞共培养24 h后细胞的存活率如图3所示，黑木耳多肽质量浓度为0.5～2.0 mg/mL时，细胞存活率与空白对照组相比没有显著性的变化（P＞0.05），这说明在此质量浓度范围内，各分子质量黑木耳多肽并不影响细胞的正常生长，可以在该质量浓度范围内进行后续实验。
黑木耳多肽对脂肪肝细胞的降脂作用
不同分子质量黑木耳多肽的降脂效果如图4所示，＜3 kDa和3～10 kDa的黑木耳多肽表现出较好的降脂活性，0.5 mg/mL时就可以显著降低细胞内TG的含量，而＞10 kDa的黑木耳多肽质量浓度为2.0 mg/mL时，也不能显著下降细胞内TG水平。随着样品质量浓度的升高，＜3 kDa和3～10 kDa的黑木耳多肽降脂效果也在提升，当质量浓度为2.0 mg/mL时，＜3 kDa 黑木耳多肽处理的细胞内TG含量与空白对照组无显著性差异（P＞0.05）。由此可知，＜3 kDa的黑木耳多肽对高脂HepG2细胞模型的降脂效果最好，所以选取＜3 kDa的黑木耳多肽用于后续实验，并将其命名为AAP-3。
3、AAP-3的活性研究
AAP-3氨基酸组成分析
AAP-3中氨基酸的组成如表2所示，其中质量分数最高的氨基酸为谷氨酸，相对含量为13.24%，质量分数最低的为半胱氨酸，相对含量为0.66%，必需氨基酸相对含量为45.44%，非必需氨基酸相对含量为54.56%，必需氨基酸与非必需氨基酸相对含量之比为0.83，是一种优质的蛋白产品。
AAP-3对HepG2细胞内TC含量的影响
由图5可知，相比于空白对照组，模型组细胞TC含量显著升高（P＜0.05），这与Youn等用PA处理HepG2细胞后的结果一致，PA会诱导胞内的TC含量提升。胆固醇代谢和脂质代谢是紧密相关的，Fungwe、Ibrahim等发现过高的胆固醇摄入会提高TG水平，并证明胆固醇可以抑制脂肪酸的氧化分解，并在这一过程中提高TG水平。
与模型组相比，0.5 mg/mL AAP-3对TC含量没有显著性影响（P＞0.05），1.0 mg/mL和2.0 mg/mL的AAP-3对细胞内TC含量都有显著性下调作用（P＜0.05），随AAP-3剂量的升高，胞内TC含量降低。模型组的TC水平是空白对照组的1.43 倍，2.0 mg/mL AAP-3处理后，TC水平是空白对照组的1.12 倍，说明AAP-3具有降低胆固醇的作用。
AAP-3对HepG2细胞HDL和LDL含量的影响
由图6可知，与空白对照组相比，模型组细胞内LDL含量显著性上升（P＜0.05），HDL含量显著性下降（P＜0.05），说明在PA的刺激下，细胞内脂蛋白的表达出现异常。
AAP-3显著降低了胞内的LDL含量，当样品质量浓度为2.0 mg/mL时，细胞内LDL含量为（2.18±0.10）mmol/g，虽然未恢复至正常水平（（1.68±0.07）mmol/g），但相较于模型组仍显著降低。与空白对照组比，模型组细胞内的HDL含量下降了38.46%，样品组随着多肽剂量的升高，胞内HDL的含量不断升高，当样品质量浓度达到1.0 mg/mL时，细胞内HDL含量与空白对照组已无显著性差异（P＞0.05），当样品质量浓度达到2.0 mg/mL时，细胞内HDL含量较空白对照组显著升高（P＜0.05）。
AAP-3对HepG2细胞的保护作用
由图7可知，模型组细胞外ALT和AST的活力相较于空白对照组显著提高（P＜0.05），说明PA对肝细胞造成了损伤，使细胞内容物外泄。AST和ALT活力随添加的AAP-3质量浓度升高而降低，具有剂量依赖性。样品质量浓度为0.5～2.0 mg/mL时，细胞外ALT水平已与空白对照组无显著性差异（P＞0.05）。胞外AST的含量在AAP-3质量浓度大于或等于1.0 mg/mL时，与空白对照组无显著性差异（P＞0.05）。
AAP-3对HepG2细胞的抗氧化作用
由表3可知，模型组相较于空白对照组，抗氧化酶CAT和SOD活力均显著降低，细胞内过氧化物MDA含量也显著提高（P＜0.05）。样品组中SOD活力随AAP-3剂量升高而升高，MDA含量随AAP-3剂量升高而减少，当AAP-3质量浓度为2.0 mg/mL时，细胞内SOD活力和MDA含量与空白对照组无显著性差异（P＞0.05），但其并未显著提升细胞内CAT的活力。
AAP-3对HepG2细胞脂质代谢的调节作用
由图8可知，相较于空白对照组，模型组中FAS、SREBP-1c的表达量显著性升高（P＜0.05），这说明PA促进了细胞内脂质的合成。样品组中随AAP-3剂量的升高，FAS、SREBP-1c的表达量逐步降低，虽然2.0 mg/mL时仍高于模型组的表达量，却显著低于模型组的转录水平（P＜0.05）。据此可推测AAP-3可通过抑制脂肪酸形成进而降低胞内TG水平。
由图9可知，模型组相较于空白对照组，PPAR-α、ATGL、AMPK、PGC-1α脂肪分解基因的mRNA表达量显著降低（P＜0.05），说明PA一定程度下调了脂肪分解相关基因。而相较于模型组，样品组中这些基因表达量都有所上调，并且总体上随着剂量上升逐步上调。其中，样品质量浓度为2.0 mg/mL时，AMPK和PPAR-α的表达量显著高于空白对照组（P＜0.05），ATGL的表达量与空白对照组无显著性差异（P＞0.05），PGC-1α的表达量仍显著低于空白对照组（P＜0.05），这些表明AAP-3一定程度上促进了脂肪分解基因的表达。
结论
在含200 μmol/L PA的培养基中生长24 h的HepG2细胞，胞内TG水平上升至阴性对照组的1.70 倍，而后与2.0 mg/mL AAP-3共培养24 h后可降低TG水平至正常细胞水平（P＞0.05）。此外，AAP-3还可降低总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、丙二醛（MDA）以及胞外谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平，提升胞内高密度脂蛋白（HDL）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，表现出降脂、降胆固醇和抗氧化的活性。通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析，发现AAP-3可降低脂肪酸合成基因FAS、SREBP-1c的转录水平，提高脂肪氧化分解相关基因AMPK、PPAR-α、PGC-1α、ATGL的转录水平。该研究结果为探索黑木耳功能性成分和植物功能性多肽提供了理论依据。
本文《黑木耳多肽对棕榈酸诱导的脂肪肝细胞的降脂作用》来源于《食品科学》2022年43卷3期106-113页，作者：陶嘉，唐超，孟凡强，周炜玮，周立邦，陆兆新。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210311-144。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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